Staphylococcus (стафилококки, род бактерий)

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus (S. aureus) посевом: в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на (в) агаризованные селективно-диагностические среды.

Допускается использование хромогенных средств предварительного выявления количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcous aureus в масложировой продукции.Метод определения наиболее вероятного числа (НВЧ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом в жидкую селективную среду предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см жидкого продукта менее 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus.

Метод определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см жидкого продукта более 150 колониеобразующих единиц (КОЕ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus.

Метод определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом в агаризованную селективно-диагностическую среду предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см жидкого продукта более 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus.(Поправка).

Приложение В (справочное). Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:ГОСТ Р ИСО 7218-2008Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиямГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условияГОСТ 450-77 Кальций хлористый технический.

Staphylococcus (стафилококки, род бактерий)

Технические условияГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условияГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условияГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализеГОСТ 24104-2001* Весы лабораторные.

Общие технические требования________________* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условияГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализовГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые.

Подготовка проб для микробиологических анализовГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмовГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильностиПримечание – При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования – на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю “Национальные стандарты”, который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году.

Приложение В(справочное)

Таблица В.1

Обозначение ссылочного межгосударственного
и национального стандарта Российской Федерации

Обозначение и наименование ссылочного международного стандарта и условное обозначение степени его соответствия ссылочному национальному стандарту

ГОСТ Р 51446-99* (ИСО 7218-96)

ИСО 7218:1996 “Микробиология продуктов питания и кормовых продуктов. Общие правила микробиологических исследований” (MOD)

ГОСТ Р 51652-2000

ГОСТ 470-77

________________
Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 450-77. – Примечание изготовителя базы данных.

ГОСТ 6672-75

ГОСТ 9284-75

ГОСТ 10444.1-84

ГОСТ 24104-2001

ГОСТ 24363-80

ГОСТ 26668-85

ГОСТ 26669-85

ГОСТ 26670-91

ГОСТ 30425-97

* С 1 января 2010 г. введен в действие ГОСТ Р ИСО 7218-2008.

Примечание – В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандартов:

– MOD – модифицированный стандарт.

УДК 663.664.001.4:006.354

ОКС 07.100.30

Н09

ОКСТУ 9109

Ключевые слова: коагулазоположительные стафилококки и S. aureus, колониеобразующие единицы (KOE), типичные и атипичные колонии, питательные среды, инкубирование посевов, реакция Фогес-Проскауера, термостабильная нуклеаза, окраска по Граму, наличие каталазы и коагулазы, наиболее вероятное число (НВЧ)

Электронный текст документаподготовлен АО “Кодекс” и сверен по:официальное изданиеПродукты пищевые, консервы.Методы микробиологического анализа:Сб. ГОСТов. – М.: Стандартинформ, 2010

Приложение А (справочное). Дифференциация коагулазоположительных видов и подвидов стафилококков по двум признакам – образованию ацетоина и ферментации мальтозы в аэробных условиях

3.1 коагулазоположительные стафилококки:Грамположительные, каталазоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные и/или атипичные колонии на или в селективно-диагностической питательной среде, дающие положительную реакцию на коагулазу или специфичную для кроличьей плазмы реакцию на агаре с кроличьей плазмой и фибриногеном при определении по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.2Staphylococcus aureus (S. аureus):Коагулазоположительные стафилококки, образующие ацетоин и ферментирующие мальтозу в аэробных условиях при определении этих биохимических тестов по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.3 выявление коагулазоположительных стафилококкови S. aureus:Определение присутствия или отсутствия коагулазоположительных стафилококков и S. aureus в определенной массе или объеме продукта по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.4 определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus:Количество коагулазоположительных стафилококков или S. aureus, содержащееся в 1 смили 1 г продукта и определенное по методам, приведенным в настоящем стандарте.

_______________* Слова “и S. aureus”  в наименовании п.4, 4.1 в бумажном оригинале выделены курсивом. – Примечание изготовителя базы данных. Сущность методовМетод выявления и метод НВЧ – определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.

4.1.1 Метод выявления коагулазоположительных стафилококкови S. aureus

4.1.1.1 Определенное количество жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции вносят в жидкую селективную питательную среду.Перед посевом анаэробные условия в среде создают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин, наслоением агара или парафина в каждую пробирку после посева, а также с помощью альтернативной процедуры – инкубирования пробирок в емкости или инкубаторе в анаэробных условиях.

4.1.1.2 Пробирки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков на Жиолитти-Кантони бульоне определяется по редукции теллурита калия, а на глюкозном или солевом бульоне – по помутнению среды.

4.1.1.3 Поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агара, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара, яично-желточно-солевого агара, агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном) инокулируют из предположительно положительных пробирок (см. 4.1.1.3) после 24 ч и все оставшиеся пробирки после 48 ч.

4.1.1.4 Чашки Петри с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.

Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по редукции теллурита калия и яично-желточной реакции (лецитиназной активности).На агаре с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном после инкубирования присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по типичным колониям, показавшим специфичную реакцию (бычий фибриноген/кроличья плазма).

4.1.1.5 Подтверждение принадлежности типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам проводят по изучению отношения выявленных микроорганизмов к окраске по Граму, определению присутствия у них каталазы и коагулазы.Подтверждение принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S.

4.1.1.6 Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков и S. aureus выражают: “обнаружены” или “не обнаружены” в x см или x граммах продукта.

золотистый стафилококк

4.1.2 Метод НВЧ – определение количества коагулазоположительных стафилококкови S.aureus

4.1.2.1 Навески продукта и (или) серию разведений навески продукта вносят в жидкую селективную питательную среду. Инкубирование посевов и подтверждение присутствия в них коагулазоположительных стафилококков и S. aureus проводят по 4.1.1.3-4.1.1.6.

4.1.2.2 Наиболее вероятное число коагулазоположительных стафилококков и S. aureus в 1 см или в 1 г продукта определяют для подтвержденных посевов, пользуясь НВЧ-таблицей по ГОСТ 26670.

_______________* Слова “и S. aureus”  в наименовании п.4, 4.1 в бумажном оригинале выделены курсивом. – Примечание изготовителя базы данных. Сущность методовМетоды определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на (в) агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве навески продукта и/или разведения навески продукта на (в) агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных и (или) атипичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.

4.2.1 Проводят посев определенного количества жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции на или в агаризованную селективно-диагностическую питательную среду на две параллельные чашки Петри.Аналогично проводят посев десятикратных разведений испытуемого продукта.

Стафилококк золотистый (staphylococcus aureus)

4.2.2 Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.

4.2.3 Количество коагулазоположительных стафилококков в 1 см или 1 г продукта определяют по числу типичных и/или атипичных колоний, выросших на чашках Петри, принадлежность которых к коагулазоположительным стафилококкам подтверждена путем определения отношения микроорганизмов из этих колоний к окраске по Граму, наличия у них каталазы и коагулазы.

При посеве в или на агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном определяют только типичные колонии и без подтверждения по биохимическим признакам их относят к коагулазоположительным стафилококкам.Количество S. aureus в 1 смили 1 г продукта определяют исходя из количества коагулазоположительных стафилококков, принадлежность которых к S.

Для подтверждения принадлежности к коагулазоположительным стафилококкам у выросших микроорганизмов и отобранных по 8.1.5, 8.2.3, 8.3.7 и 8.4.4 определяют отношение к окраске по Граму, способность коагулировать плазму крови кролика и способность образовывать каталазу.

_______________* Наименование п.9.1 в бумажном оригинале выделено курсивом. – Примечание изготовителя базы данных. Из культур готовят мазки, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425 и микроскопируют.Коагулазоположительные стафилококки положительно окрашиваются по Граму, имеют шарообразную форму, клетки диаметром 0,6-1,0 мкм, располагающиеся чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.

_______________* Наименование п.9.2 в бумажном оригинале выделено курсивом. – Примечание изготовителя базы данных. Способность выросших микроорганизмов образовывать каталазу определяют по ГОСТ 30425. Коагулазоположительные стафилококки образуют каталазу.

9.3.1 Способность коагулировать плазму крови кролика определяют у микроорганизмов, окрашивающихся положительно и образующих каталазу.

9.3.2 На Байрд-Паркер агаре с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном подсчитывают количество типичных колоний с зоной преципитации, указывающей на коагулазную активность, и эти колонии без дальнейшего подтверждения считают относящимися к коагулазоположительным стафилококкам.

9.3.3 Соблюдая правила асептики, в стерильные пробирки подходящего размера (например, 10х75 мм) добавляют 0,1 см каждой культуры, выросшей на среде (см. 5.2) по 8.1.5, 8.2.3, 8.3.7 и 8.4.4, и 0,3 см плазмы кролика (если изготовителем кроличьей плазмы не установлены другие количества) и инкубируют при температуре 37 °С.

Опрокидывая пробирку, исследуют плазму на свертывание после 4-6 ч инкубирования и, если тест отрицательный, просматривают через 24 ч инкубирования или исследуют после инкубационного периода продолжительностью, установленной изготовителем кроличьей плазмы.Тест на коагулазу считают положительным, если культура показала, по крайней мере, 3 – оценку коагулазной реакции, отмеченной на рисунке 1. Реакция на 1 или 2 оценивают как промежуточную.

Приложение А(справочное)

Таблица А.1

Наименование тестов

S. aureus

S. delphini

S. hyicus

S. intermedius

S. schleiferi subsp. coagulans

subsp. anaerobius

subsp. aureus

Образование ацетоина

Ферментация мальтозы в аэробных условиях

w

Примечание – ” ” означает, что 90% или более штаммов положительные; “-” означает, что 90% или более штаммов отрицательные; “w” означает, что реакция слабая; “отсутствие обозначения” означает, что определение показателя не проводилось.

5 Питательные среды, растворы реактивов, эмульсии и дефибринированная кровь

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред, растворов реактивов, эмульсий, должны быть аналитического качества.

5.1 Агаризованная среда Байрд-Паркера

5.1.1 Основа среды

ферментативный гидролизат казеина

10,0 г;

дрожжевой экстракт

1,0 г;

мясной экстракт

5,0 г;

пируват натрия

10,0 г;

L-глицин

12,0 г;

хлорид лития

5,0 г;

агар

от 12 до 22 г*;

вода

1000 см.

________________* В зависимости от желирующей способности агара.

Staphylococcus (стафилококки, род бактерий)

5.1.1.2 ПриготовлениеПри нагревании растворяют в воде все компоненты или дегидратированную основу. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,2) при температуре 25 °С.Разливают среду по 100 см в колбы или флаконы соответствующей вместимости.Стерилизуют среду в автоклаве при температуре (121±1) °С в течение 15 мин.

5.1.2 Раствор теллурита калия

теллурит калия (KTeO)

1,0 г;

вода

100 см.

Примечание – Необходимо предварительно убедиться, что имеющийся в наличии теллурит калия пригоден для данного испытания.

5.1.2.2 ПриготовлениеПолностью растворяют теллурит калия в воде при минимальном нагревании.Твердое вещество должно легко растворяться. Если в воде присутствует белый нерастворимый осадок, то такой порошок не используют.Стерилизуют приготовленный раствор теллурита калия путем фильтрации через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.Раствор можно хранить не более 1 мес при температуре (3±2) °С.Если при хранении раствора образуется белый осадок, то такой раствор не используют.

5.1.3 Эмульсия яичного желтка (приблизительно 20%-ной концентрации)Свежие куриные яйца с неповрежденной скорлупой моют щеткой с применением жидких моющих средств, ополаскивают проточной водой, дезинфицируют погружением на 30 с в 70 %-ный (объем/объем) этиловый спирт с последующим просушиванием на воздухе или, после того как раствор спирта стечет, яйца фламбируют в пламени горелки.

С соблюдением правил асептики разбивают скорлупу яйца и отделяют желток от белка, поочередно перенося желток из одной половинки скорлупы в другую. Желтки помещают в стерильную колбу и добавляют 4-кратное количество (по объему) стерильной воды. Смесь тщательно перемешивают, выдерживают на водяной бане при температуре (47±1) °С в течение 2 ч, а затем оставляют на 18-24 ч при температуре (3±2) °С для образования осадка.

Для использования собирают в асептических условиях в стерильную колбу надосадочную жидкость. Приготовленную эмульсию можно хранить при температуре (3±2) °С не более 72 ч.Допускается использование готовой эмульсии промышленного производства, в этом случае эмульсию применяют в соответствии с инструкцией изготовителя.Допускается проводить приготовление желточной эмульсии по ГОСТ 10444.1.

5.1.4 Раствор сульфаметазина (сульфамезатина, cульфадимидина)Раствор используют только в случае подозрения присутствия в испытуемом продукте бактерий рода Proteus или при испытании сильно обсемененных продуктов, например, из сырого мяса.

сульфаметазин

0,2 г;

раствор гидроксида натрия, (NaOH)=0,1 моль/л

10 см;

вода

90 см.

5.1.4.2 ПриготовлениеРастворяют сульфаметазин в растворе гидроксида натрия. Доводят объем водой до 100 см. Стерилизуют путем фильтрации через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Приготовленный раствор допускается хранить не более 1 мес при температуре (3±2) °С.

5.1.5 Готовая питательная среда

основа среды (см. 5.1.1)

100 см;

раствор теллурита калия (см. 5.1.2)

1,0 см;

эмульсия яичного желтка (см. 5.1.3)

5,0 см;

раствор сульфаметазина (см. 5.1.4) (если необходимо)

2,5 см.

5.1.5.2 ПриготовлениеРасплавляют основу, затем охлаждают до температуры примерно 47 °С на водяной бане. В асептических условиях добавляют два других раствора и, если необходимо, раствор сульфаметазина (см. 5.1.4). Предварительно каждый раствор подогревают на водяной бане при 47 °С, тщательно перемешивая среду после каждого прибавления раствора.

5.1.6 Приготовление чашек Петри с агаризованной средой Байрд-ПаркераРазливают соответствующее количество готовой среды (см. 5.1.5) в стерильные чашки Петри, чтобы получить агаровый слой толщиной примерно 4 мм, и дают застыть. Приготовленные чашки можно хранить до использования 24 ч при температуре (3±2) °С.

5.2 Бульон на основе вытяжки из сердца и мозга

продукт ферментативного гидролиза животных тканей

10,0 г;

дегидратированная вытяжка мозга теленка

12,5 г;

дегидратированная вытяжка сердца теленка

5,0 г;

глюкоза

2,0 г;

хлорид натрия

5,0 г;

двузамещенный фосфорнокислый натрий, безводный (NaHPO)

2,5 г;

вода

1000 см.

5.2.2 ПриготовлениеПри нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде.Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С (7,4±0,2).Разливают питательную среду по 5-10 см в пробирки. Стерилизуют среду в течение 15 мин при температуре (121±1) °С.

5.3 Плазма крови кролика

Staphylococcus (стафилококки, род бактерий)

5.3.1 Свежеполученную в асептических условиях из сердца кролика кровь тщательно смешивают в соотношении 4:1 со стерильным раствором лимоннокислого натрия (цитрата натрия). Полученную смесь центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин или отстаивают на холоде при температуре (3±2) °С, затем плазму отсасывают пипеткой и разводят ее из расчета 1 смплазмы на 4 смфизиологического раствора.

Разведенную плазму по 0,5 смразливают в стерильные пробирки.Если в качестве антикоагулянта плазмы использовались цитраты калия или натрия, то к плазме добавляют раствор ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) до концентрации ЭДТА в плазме 0,1%. В плазму, содержащую оксалат или гепарин ЭДТА, не добавляется.

Для приготовления агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном к плазме добавляют трипсин из расчета 30 мг трипсина на 30 см плазмы. Плазму готовят непосредственно перед применением.Если используется готовая обезвоженная плазма, то восстановление и использование такой плазмы проводят в соответствии с прилагаемой к ней инструкцией.

5.3.2 Раствор лимоннокислого натрия

лимоннокислый натрий

5,0 г;

вода

100 см.

5.3.2.2 ПриготовлениеЛимоннокислый натрий помещают в колбу, растворяют в воде. Раствор доводят до метки, разливают по колбам или пробиркам и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

5.4 Агаризованная среда с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеномСледует учитывать опыт использования готовых партий добавок. Рекомендуется каждую партию раствора бычий фибриноген/кроличья плазма подвергать тестированию путем постановки положительного и отрицательного контроля.

5.4.1 Основа средыОснову среды готовят по 5.1, но перед стерилизацией среду разливают по 90 см в колбы или флаконы.

5.4.2 Раствор бычьего фибриногена

________________* Зависит от чистоты бычьего фибриногена.

стерильная вода

100 см.

5.4.2.2 ПриготовлениеС соблюдением правил асептики растворяют бычий фибриноген в воде непосредственно перед использованием.

5.4.3 Кроличья плазма и трипсин ингибирующий раствор

кроличья плазма с ЭДТА для коагулазы (ЭДТА коагулазная плазма)

30 см;

трипсин ингибитор

30 мг.

5.4.3.2 ПриготовлениеРаствор готовят с соблюдением правил асептики, растворяют компоненты в воде непосредственно перед использованием.Если используют готовый раствор бычий фибриноген/кроличья плазма, то необходимо соблюдать инструкцию по приготовлению данного раствора и готовой среды. Особенно надо обращать внимание на температуру основы среды. При несоблюдении температуры среда может потерять свою активность.

5.4.4 Готовая среда

основа среды (см. 5.4.1)

90 см;

раствор теллурита калия (см. 5.1.2)

0,25 см;

раствор фибриногена (см. 5.4.2)

7,5 см;

кроличья плазма и трипсин ингибирующий раствор (см. 5.4.3)

2,5 см.

5.4.4.2 ПриготовлениеРасплавляют основу среды, охлаждают в водяной бане до температуры (47±1) °С. С соблюдением правил асептики прибавляют три раствора, предварительно подогретых до (47±1) °С в водяной бане. Тщательно перемешивают среду вращением после каждого прибавления, минимизируя вспенивание.Используют готовую среду непосредственно после приготовления, тем самым избегая преципитации плазмы.

5.5 Модифицированный Жиолитти-Кантони бульон

5.5.1 Основа среды

5.5.1.1 Состав модифицированного Жиолитти-Кантони бульона приведен в таблице 1.

Таблица 1

Наименование компонента

Среда двойной концентрации

Среда нормальной концентрации

Ферментативный гидролизат казеина

20,0 г

10,0 г

Мясной экстракт

10,0 г

5,0 г

Дрожжевой экстракт

10,0 г

5,0 г

Хлористый литий

10,0 г

5,0 г

Маннит

40,0 г

20,0 г

Хлористый натрий

10,0 г

5,0 г

Глицин

2,4 г

1,2 г

Пируват натрия

6,0 г

3,0 г

Полиоксиэтилен сорбитан моноолеат (твин-80)

2,0 г

1,0 г

Вода

1000 см

1000 см

5.5.1.2 ПриготовлениеПри нагревании и помешивании растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде. Охлаждают до комнатной температуры и устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (6,9±0,2) при температуре 25 °С.Разливают среду в соответствующем количестве в пробирки соответствующего объема – 16×160 мм для среды нормальной концентрации и 20×200 мм – для среды двойной концентрации.Стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1) °С в течение 15 мин.

5.5.2 Готовая средаПеред использованием в водяной бане прогревают основу среды 15 мин при 100 °С для удаления воздуха.Охлаждают до 44 °С – 47 °С, асептически прибавляют раствор теллурита калия по 5.1.2, внося 0,1 см на пробирку в среду нормальной концентрации и 0,2 см в пробирку со средой двойной концентрации.

5.6 Голодный агарГолодный агар готовят по ГОСТ 10444.1.Перед использованием охлаждают до 44 °С – 47 °С. Наливают в пробирки соответствующего объема.

5.7 Молочно-солевой агарМолочно-солевой агар готовят по ГОСТ 10444.1.

5.8 Мясопептонный агар (бульон)Мясопептонный агар (бульон) готовят по ГОСТ 10444.1.

5.9 Солевой или сахарный бульон

мясопептонный бульон по ГОСТ 10444.1

100 см;

хлористый натрий

6,0 г;

или глюкоза

1,0 г.

7 Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб – по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.Важно, чтобы для испытания поступила представительная проба продукта, не поврежденная и не измененная в ходе транспортирования или хранения.

8 Проведение испытания

8.1.1 При выявлении коагулазоположительных стафилококков в определенной навеске исследуемого продукта или его эквивалентном разведении с предварительным обогащением эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред, приготовленных по 5.5 или 5.9.Перед использованием Жиолитти-Кантони бульон прогревают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин для удаления воздуха.

Охлаждают до 44 °С – 47 °С и с соблюдением правил асептики прибавляют раствор теллурита калия.В 10 см модифицированного Жиолитти-Кантони бульона нормальной концентрации или сред (см. 5.9) вносят 1 см жидкого продукта или 1 см исходной суспензии (т.е. 0,1 г или 0,1 см продукта) или в 10 см Жиолитти-Кантони бульона двойной концентрации вносят 10 см жидкого продукта или 10 см исходной суспензии (т.е.

1 г или 1 см продукта). Для посева больших объемов навески испытуемого продукта приготавливают исходную суспензию, для этого хсм или хг продукта прибавляют к 9·х см разбавителя. Затем прибавляют всю исходную суспензию к 9·х·10 см модифицированного Жиолитти-Кантони бульона нормальной концентрации (например, 5 см или 5 г вносят в 45 см разбавителя и затем эту всю исходную суспензию вносят в 450 см модифицированного Жиолитти-Кантони бульона нормальной концентрации).

Оставляют минимум воздушного пространства в пробирке или флаконе.После посева навески продукта и (или) его разведений на поверхность Жиолитти-Кантони бульона осторожно наслаивают слой стерильного голодного агара или слой стерильного парафина, приготовленных по ГОСТ 10444.1 и охлажденных до температуры 44 °С – 47 °С, дают полученному слою агара или парафина застыть и герметично закрывают.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой нормальной концентрации 1:10. При использовании среды двойной концентрации соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой 1:1.Если при последующем подтверждении принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S.

aureus не определяют наличие термостабильной нуклеазы и гемолитической активности, то допускается проводить посев в Жиолитти-Кантони бульон без прогрева перед посевом и без наслаивания голодного агара или парафина после посева.При испытании высококислотных продуктов для предотвращения резкого снижения рН (на 0,5 и более) питательных сред рН питательных сред после внесения в них продукта или его разведений доводят до допустимых значений с помощью стерильного раствора гидроокиси натрия, приготовленного по ГОСТ 10444.

Допускается доводить рН до нейтрального значения с помощью стерильного раствора гидроокиси натрия в самом высококислотном продукте.При анализе пищевых продуктов с большим содержанием хлористого натрия (NaCl) посев исследуемого продукта или его исходного разведения в солевой бульон не проводят. Содержание хлористого натрия (NaCl) в посевах не должно быть более 6,5%-7%.

8.1.2 Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если появилось почернение или черный осадок в Жиолитти-Кантони бульоне или помутнение в солевом или сахарном бульоне, то проводят подтверждение принадлежности выросших микроорганизмов к коагулазоположительным стафилококкам. Если почернения, черного осадка или помутнения нет, то посевы инкубируют еще (24±2) ч.

8.1.3 Для получения изолированных колоний стерильной петлей делают пересевы культур из каждого посева (см. 8.1.2) на поверхность чашки Петри с одной из агаризованных селективно-диагностических сред: Байрд-Паркер агара, Байрд-Паркер агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара или яично-желточно-солевого агара (см. раздел 5).

Пересевы проводят также из пробирок, в которых нет видимых признаков роста.Если на поверхность Жиолитти-Кантони бульона наслаивали голодный агар или парафин, то перед пересевом с соблюдением правил асептики их удаляют, используя для этого стерильный шпатель. Шпателем режут слой агара на четыре части вдоль и, если необходимо, вставляют шпатель в пробирку и проводят по окружности агара для освобождения его от стекла пробирки.

8.1.4 После 24 ч инкубирования чашек Петри по 8.1.3 отмечают на дне чашек присутствие типичных и атипичных для коагулазоположительных стафилококков колоний.На Байрд-Паркер агаре после инкубирования в течение 24 ч коагулазоположительные стафилококки образуют типичные колонии черного или серого цвета блестящие и выпуклые, окруженные прозрачной зоной, диаметр колоний около 1,0-1,5 мм и до 1,5-2,5 мм после инкубирования в течение 48 ч. После инкубирования в течение 24 ч непосредственно около колонии в прозрачной зоне может появиться опалесцирующее кольцо, окружающее колонию.

а) блестящие черные колонии с узкой белой кромкой или без нее; прозрачная зона отсутствует или едва видима, а опалесцирующее кольцо отсутствует или трудно различимо;

б) серые колонии без прозрачных зон.Все колонии, возможно присутствующие на чашках Петри и не показавшие типичных и атипичных признаков, относятся к фоновой флоре.Микроорганизмы, принадлежащие к родам, отличным от коагулазоположительных стафилококков, могут образовывать колонии, которые по внешнему виду похожи на колонии коагулазоположительных стафилококков.

8.1.5 Для подтверждения принадлежности типичных и атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам отбирают не менее пяти типичных и/или атипичных колоний.Для подтверждения принадлежности отобранных типичных и атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам пересевают каждую отобранную колонию отдельно в жидкую среду, приготовленную по 5.

Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

8.2.1 Каждую навеску исследуемого продукта и (или) его разведение в трехкратной повторности высевают в пробирки с одной из сред, приготовленных по 5.5 или 5.9.

8.2.2 При определении количества коагулазоположительных стафилококков по методу НВЧ высевают не менее трех последовательных навесок исследуемого продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз.В каждую из трех пробирок со средой двойной концентрации вносят по 10 см пробы жидкого продукта или по 10 см первого разведения (т.е.

1 г пробы) продукта другой консистенции.В каждую из трех пробирок со средой нормальной концентрации вносят по 1 см пробы жидкого продукта или 1 см первого разведения (т.е. 0,1 г пробы) других продуктов.Для каждого последующего разведения (т.е. 10, 10, 10 – для жидких продуктов или 10, 10 или 10 для продуктов другой консистенции), процедуру повторяют, как указано выше, используя свежую стерильную пипетку для каждого разведения.

8.2.3 Инкубирование пробирок с посевами, пересев выросших культур на селективно-диагностические среды, отбор типичных и атипичных колоний, их пересев для подтверждения присутствия коагулазоположительных стафилококков проводят по 8.1.2-8.1.5.

Абсцесс, вызванный метициллин-резистентыми золотистыми стафилококками

8.3.1 Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 таких, чтобы можно было определить в 1 г (см) продукта предполагаемое количество коагулазоположительных стафилококков или их допускаемое количество, указанное в документе на исследуемый продукт.Переносят с помощью стерильной пипетки 0,1-0,2 см продукта, если продукт жидкий, или 0,1-0,2 см исходной суспензии в случае продуктов другой консистенции, на поверхность одной из сред, указанных в 8.1.3.

Байрд-Паркер агар с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном используют для посева сильно обсемененных продуктов, например, приготовленных из сырого мяса.Для посева продукта или каждого его разведения используют две параллельные чашки Петри со средой. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670 и 5.1.6.

Рейтинг
( Пока оценок нет )
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
onivnas.ru